4. Проблемы, связанные с
автоматическим подсчетом
Все клетки на одной картинке: слишком медленно
Детальное рассмотрение: проблемы
дуплетов и «половин» клеток
Каждая клетка отдельно: слишком медленно
1-Feb-13 4
9. Пример: научные исследования
Сортировка спермы Культивирование дрожжей Трансдукция сигнала
Жизнеспособность бактерии
X
Y
1-Feb-13 9
10. Какие из этого возникают сложности?
• Различные составляющие образца
Транспортировка, хранение, приготовление образца, обработка патогенов
• Сложные технологии
Адекватные условия окружающей среды, спецификация и обслуживание
прибора
• Множество пользователей
Обучение, подготовка к работе на инструменте, документирование
1-Feb-13 10
11. Нормативы для лабораторий
• Фундаментальные исследования: MIFlowCyt
• Анализ в фармацевтических исследованиях и тестированиях
на безопасность лекарственных средств: GLP Good
Laboratory Practice – свод международных требований к
лабораторным исследованиям (законодательно регулируемо)
• Анализ последующего использования в цикле разработки
лекарственных средств для мониторинга пациентов в
клинических испытаниях и т.д.: схожие с GLP условия
• Анализ в виде контроля качества фармацевтической
продукции: GMP Good Manufacturing Practice – свод
международных требований к производству
• Медицинские диагностические лаборатории: Директивы
Ассоциации Медицинских Работников, Аккредитация
1-Feb-13 11
12. Общие требования
Персонал: экспертиза, авторизация
Помещения: доступ, условия окружающей среды
Оборудование: обслуживание, отчеты
Реагенты, логистика
Валидированные процедуры
Внутренний и внешний контроль качества
Референсные значения
Соответствующая интерпретация
Все должно быть задокументировано!
1-Feb-13 12
15. Good Laboratory Praxis (GLP)
Если это не специфичные случаи, описанные
государственным законодательством, правила GLP
применяются ко всем неклиническим исследованиям
по охране здоровья и окружающей среды,
требующие соблюдения правил регистрации или
лицензирования фармацевтики, пестицидов,
пищевых и кормовых добавок, косметических
продуктов, ветеринарных лекарственных и схожих
продуктов и для установления норм дляпромышленных
химических продуктов.
ВНИМАНИЕ: GLP может иметь различное значение в
разных странах! США: общие положения; Европа:
юридический характер!
1-Feb-13 15
16. Что такое GLP?
• Документация, Документация…
Если это не написано, значит, Вы этого не делали!
Лабораторные записи могут «привести» к патентам и
обеспечить финансовую основу для будущей работы!
• Стандартизация
Требует постоянных условий
Повышает качество результатов и, следовательно, качество публикаций,
диссертаций и т.д.
1-Feb-13 16
17. Что нужно документировать?
• Исходные данные
• Тестовые процедуры
• Реагенты и материалы
• Записи по подготовке
• Журналы по оборудованию и оснащению
• Записи по обслуживанию инструмента
• Записи проверки оборудования
Документы по каждодневной лабораторной
работе:
• Лабораторный журнал
• Записи в журнал инструмента
• Стандартные процедуры оператора (SOP)
1-Feb-13 17
18. Стандартные процедуры оператора
В клинических исследованиях, SOP
определяются International Conference on
Harmonisation (ICH – Международной
Конференцией по Согласованию) как
«детальные написанные инструкции для
достижения единообразия в действии
специфических функций". (Wikipedia)
• Разъяснить как осуществляются рутинные каждодневные
действия
• Обеспечить взаимодействие между исследователями
• Обеспечить полезность для обучения новых пользователей
• Сформировать основу для внедрения системы управления
качества
• Обновлять каждые два года
1-Feb-13 18
19. Основные требования: персонал
• Квалификация и обучение
• Предписанные установленные обязанности
• Документация о знаниях и компетенциях
• Адекватное число сотрудников (вакансия!)
• Авторизации
• Периодическое обучение и тренинги
• Документация по всем тренингам
1-Feb-13 19
20. Основные требования: помещения
• Использовать для необходимых подтверждений (ГМО,
биологические риски и т.д.)
• Оценка риска (лазер, патогены и т.д.)
• Соблюдение условий среды (температура, влажность,
шум, выбрасываемый воздух и т.д.)
• Исключение кросс-контаминации (молекулярная
биология)
• Очистка помещения
• Процедуры по дезинфекции
• Утилизация отходов в соответствии с правилами
• Хранение расходных материалов и реагентов
1-Feb-13 20
21. Основные требования: оборудование
• Регулярные инспектирование и калибровка
• Отчеты по техническому обслуживанию
• Руководства, заметки производителя и SOP
• Правила в случае неисправности системы
• Авторизация сотрудников лаборатории
• Документирование рабочего времени оборудования
(журнал учета)
• Правила для коллективного использования цитометров
различными группами
• Журнал пользователя
1-Feb-13 21
22. Факторы, влияющие на ЦФ анализы
Подготовка
Абсолютный подсчет
• Фиколл или лизис
(клетки/мкл)
• С промывкой / без
• Одноплатформенный или
промывки
двуплатформенный
• Антикоагулянты
Флуорохромы Гейтирование
• 2,3,4…32 цвета • Иммунологическое гейтирование
• Коньюгаты • Опознание живая/неживая
• Контроли • Дискримнация дуплетов
• Компенсация
Цитометр
Нормативные директивы
• Спецификации (лазер,
• GLP, аккредитация
фильтры…)
• Планы исследования
• Контроль лазеров и проточной
• Правила компенсации
системы
1-Feb-13 22
23. Пробоподготовка
Антикоагулянты
• Аммоний-гепарин: наиболее стабилен (48 ч)
• ЭДТА: удобен, но должен быть использован в
течение 12 ч
• Цитрат: воздействует на поверхностные
маркеры
Лизис
• Хлорид аммония pH- нестабилен
• Versalyse подходит также для безотмывочной пробоподготовки
(абсолютный подсчет!)
• Каждый материал для лизирования приводит к различиям в
характеристиках рассеяния клеток
• Лизис с фиксацией наиболее стабилен. ВНИМАНИЕ: оценка
жизнеспособности!
Агрегаты клеток
• Клеточные фильтры (40 мкм) предотвращают засорение
• Добавление ДНКзы или Коллагеназы / Диспазы
1-Feb-13 23
25. Законы Шапиро по цитофлуориметрии
http://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/flow-cytometry/practical-flow-cytometry/index.html
1-Feb-13 25
26. Жизнеспособность клеток
7-AAD в зависимости от SSC :
погибшие клетки 7-AAD+
исключены
Погибшие клетки неспецифично связывают антитела и,
следовательно, могут приводить к ложно-положительным
результатам.
1-Feb-13 26
27. Абсолютный подсчет (клетки/ мкл)
• Возможно только с неотмытыми образцами (потеря
клеток!)
• 2 метода: «единая платформа» и «двойная платформа»
Единая платформа: Двойная платформа:
FlowCount-Beads
% Lymph
WBC
«Золотой стандарт»; подсчет Абсолютный подсчет проведен по
частиц известной концентрации, результатам цитометрических и
добавленных в ту же пробирку в гематологических данных.
качестве референсных частиц.
Недостаток: 2 источника ошибок!
1-Feb-13 27
28. Референсные значения
• Могут зависеть от возраста
• Могут зависеть от пробоподготовки (напр. реагенты
для лизирования)
• Должны быть валидированы для каждого инструмента
Гематологические параметры при
исследовании мышей показывают
удовлетворительные
штаммоспецифические различия!
Ссылка:
http://jaxmice.jax.org/findmice/index.html
1-Feb-13 28
30. Суточные ритмы
Работа иммунитета
меняется в течение суток
Суточные часы в макрофагах
контролируют воспалительный
иммунный ответ. Keller M,
Mazuch J, Abraham U, Eom GD,
Herzog ED, Volk HD, Kramer A,
Maier B.
Proc Natl Acad Sci U S A.
2009 Dec 15;106(50):21407-12.
1-Feb-13 30
31. Иммунологическое гейтирование
Forward Scatter
Monos CD8+ LYM
Side Scatter
26.2%
CD8 FITC
Gran CD3+
Lymph 76.6% CD4+ LYM
49.4%
Debris
Side Scatter CD3 PC7 CD4 Pacific Blue
Granulocytes
«Иммунологическое
гейтирование» (напр. CD45 от
SSC
Monocytes SSC) часто позволяет лучше
Debris
дискриминировать популяции,
Lymphocytes
чем гейтирование по рассеянию.
CD45-PC7
1-Feb-13 31
35. Дискриминация дуплетов
Представленные методы:
Height vs. area Ratio vs. area Height vs. area
Цитометр анализирует частицы, но не может различать
единичные события от дуплетов или агрегатов.
Это приводит к ошибочным результатам, особенно
когда анализируется ДНК или редкие события!
1-Feb-13 35
36. Контроль
Параметры, которые необходимо
контролировать:
• автофлуоресценция
• неспецифическое связывание
антител
• спектральное перекрывание
1-Feb-13 36
37. Автофлуоресценция
Лазеры возбуждают не только флуорохромы, но и молекулы в клетке,
такие как флавопротеины, NADPH, липиды и т.д.
Чем больше составляющих клетки, тем сильнее автофлуоресценция!
Автофлуоресценция зависит от длины волны возбуждения.
1-Feb-13 37
38. Контроль внутренних негативных
событий
Негативная популяция в той же
пробирке.
Преимущества: негативные и
исследуемые клетки
обработаны при равных
условиях.
Часто он может заменить
изотипический контроль.
Комбинирует
автофлуоресценцию с
неспецифическим связыванием.
1-Feb-13 38
39. Изотипический контроль
• Анализ неспецифического связывания («контрольная проба»).
• Важно когда нет «внутренних» негативных популяций.
• Контрольные изотипы должны быть связаны с одними и теми же флуорохромами.
• Дополнительное преимущество: расчет относительного изменения в
интенсивности флуоресценции.
MF=1,84 MF=164
(1,0) (89,13)
1-Feb-13 39
41. Изотипический контроль
Предварительные условия для хорошего изотипического контроля:
идентичные условия для изотипического контроля и специфического
антитела!
• Одинаковый изотип!
• Одинаковый флуорохром!
• Концентрация антител при процессе «окрашивания».
• Температура и время инкубации.
• Одинаковый буфер для окрашивания.
• Тандемные коньюгаты от одного производителя.
1-Feb-13 41
42. Выбор антител
Pacific Blue®**
Biotin PE PECy5
ECD PECy7/APCy7
FITC FITC
APC PECy5.5
Relative Fluorescence
Cyanine dyes
Alexa Fluor Dyes®**
Alexa Fluor 488
Alexa Fluor 647
Alexa Fluor 700
PE
APC
Tandem Dyes
PE-Texas Red 500nm 600nm 700nm 800nm
PE-Cy5 Emission Wavelength
PE-Cy5.5
PE-Cy7
APC-Alexa Fluor 700 Флуорохромы с минимальным или нулевым
APC-Cy7
APC-Alexa Fluor 750 спектральным перекрытием упрощают
компенсацию.
С участием тандемных красителей возможно
возбуждать и детектировать сигнал до 5
**Registered Product from Invitrogen, Inc. (Molecular Probes, Inc)
флуорохромов одним лазером.
1-Feb-13 42
44. Спектральное перекрывание
• Необходимо: одноцветное окрашивание для каждого флуорохрома на
панели
• Для анализа спектрального перекрытия должны расматриваться яркие
сигналы
Компенсация зависит от настройки напряжения!
1-Feb-13 44
46. Компенсация
Median fluorescence
intensity
1-Feb-13 46
47. Избегать компенсации если это
возможно
На 3-лазерном инструменте FITC, PC7,
APC и Pacific Blue могут быть
638nm
проанализированы без компенсации!
488nm
405nm
1-Feb-13 47
49. 4 флуорохрома без компенсации
488nm
APC
638nm
Pac Blue
405 nm
1-Feb-13 49
50. Практические методы
Основное:
• Слабоэкспрессирующиеся антигены лучше работают с ярким красителем.
• Сильноэкспрессирующеся антигены работают со всеми красителями.
• НО: НУЖНО учитывать спектральное перекрывание!!
• Слабоэкспрессируемые антигены лучше работают на каналах, которые
не подвержены воздействию спектрального перекрывания.
• Яркие антигены лучше работают на каналах, которые не воздействуют
спектральным перекрыванием на другие каналы.
PE PECy5
ECD PECy7/APCy7
FITC
APC PECy5.5
Relative Fluorescence
500nm 600nm 700nm 800nm
Emission Wavelength
1-Feb-13 50
51. Практические методы
Допускается спектральное перекрывание…
• Между взаимоисключающими маркерами (например, CD3 и CD19, или
CD4 и CD8)
1-Feb-13 51
52. Практические методы
Допускается спектральное перекрывание…
• от маркеров субпопуляции к родительским маркерам (напр. CD4 к CD3)
1-Feb-13 52
56. Концеция Контроля Качества
Системная проверка
(Ежедневно)
Fluidiktest +
Проточная система
лазер
Анализ образцов
Решение пациентов
Стандартизация
проблемы Документрование
Настройка инструмента
Call-центр Контроль качества
(QC)
Получение
Результаты
результатов
Компенсация
Спектральное QC Модуль
Обслуживание перекрывание
пприбора Подготовка
Контрольный отчета
материал
Проверка результатов
ОШИБКА
ПРОЙДЕНО
1-Feb-13 56
57. CE / IVD - одобрение
Построено на ISO стандартах в целях
соответствия наивысшим стандартам
качества конструкции и производства
Инвестирование в тестирование продукта
для достижения наивысших нормативных
стандартов сложного медицинского
оборудования
IVD
CE соответствие для всех конфигураций, включая 3-й лазер ?!
1-Feb-13 57
59. Контроль процесса: права и обязанности
Многопользовательский доступ Администрирование прав пользователя
Управление паролем пользователя
Записи пользователя/ журнал регистрации
событий
1-Feb-13 59
60. Контроль процесса: штрих-коды
Считывание штрих-кода
карусели
положения в
карусели
пробирок
Максимально
возможная
идентификация
образца
1-Feb-13 60
61. Контроль процесса: удаленный доступ
Система PROService
автоматически
идентифицирует,
отслеживает и решает
проблемы дистанционно
PROService обеспечивает
удаленный доступ к
программному обеспечению,
осуществляющему мониторинг
всей электроники, насосов,
клапанов и т.д. внутри
прибора.
1-Feb-13 61
62. Ежедневная проверка системы:
Flow-Check™
Частицы Flow-Check™ (6605359)
– проверка проточной системы и оптики
– для Cytomics FC 500 дополнительно
• Flow Check 770 от PC7 Set up Kit (737664) = конфигурация с 1 лазером
• Flow Check 675 от APC Set up Kit (737663) = конфигурация с 2 лазерами
1-Feb-13 62
66. База данных реагентов
– Управление
каталожными номерами
и номерами партии
– документирование
сроков годности и
получения
– связана с графиками
Леви-Дженнингса
– простое добавление
новых реагентов
1-Feb-13 66
70. Полностью автоматизированные
процедуры
4 флуоресцентных сигнала: TBNK
FITC PE ECD PC5
CD45 CD4 CD8 CD3
CD45 CD56+16 CD19 CD3
Для Navios 6C, Navios 8C, Navios 10C, FC500, Epics XL
6 флуоресцентных сигналов: TBNK плюс маркеры активации (дополнительно*)
FITC PE ECD PC5 PC7 APC-A750
CD45 CD56+16 CD19 CD3 IgG IgG
CD45 CD4 CD8 CD3 HLA-DR CD38
Для Navios 6C, Navios 8C, Navios 10C * Возможны и другие дополнительные маркеры, напр. CD25-PC7
Только для исследовательских целей
1-Feb-13 70
71. Контрольные материалы
ImmunoTrolTM:
иммунофенотипирование
ImmunoTrol LowTM:
ВИЧ
StemTrolTM:
CD34+ клетки-предшественники
Использование контрольных материалов позволяет валидировать
применяемые настройки инструмента и, следовательно, является
контролем достоверности работы.
1-Feb-13 71
73. Программы внешнего QC
Программы внешнего контроля качества External Quality
Assessment (EQA) приняты во всем мире как бесценные средства
для оценки лабораториями работы своих тестирующих систем.
Результаты объективно сравниваются с результатами других
лабораторий, использующих ту же методологию для каждого
параметра.
1-Feb-13 73
76. Концепция полезного QC модуля
Все приложения могут быть
•стандартизированы
• задокументированы (SOP)
• установлены без субъективного ручного
ввода
Все параметры (QC реагенты, работы по обслуживанию,
автоматически
настройки цитометра и результаты анализа)
документируются QC модулем.
1-Feb-13 76
77. Контроль качества: цели
• Стандартизированные процессы
• Стандартизированное приготовление образца
• Контролируемые образцы
• Стандартизированная настройка протоколов
сбора данных
• Контроль действий и QC документация
Относительность результатов
• Меньше ручных манипуляций во время работы и
бОльшая высокопроизводительность
• Гибкая работа с образцами
• Упрощенная работа с образцами
1-Feb-13 Повышение эффективности 77
79. Для чего этот продукт?
Он влияет на качество Ваших результатов!
1-Feb-13 79
80. Вопросы? Комментарии?
Спасибо за внимание!
Dr. Andreas Böhmler
Product Manager Flow Cytometry
Reagents and Applications
Europe, Middle East, Africa & India
aboehmler@beckmancoulter.com
1-Feb-13 80
